甲基化特異性PCR

標簽：甲基化特異性 PCR

DNA甲基化是一種表觀遺傳修飾，它是由DNA甲基轉移酶（DNA methyl-transferase, Dnmt）催化S-腺苷甲硫氨酸作為甲基供體，將胞嘧啶轉變為5-甲基胞嘧啶（mC）的一種反應，在真核生物DNA中，5-甲基胞嘧啶是唯yi存在的化學性修飾堿基。

實驗方法原理	MSP是一種簡便、特異的、敏感的檢測單基因甲基化的方式。其基本原理是用亞硫酸氫鈉處理基因組DNA，未甲基化的胞嘧啶變成尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶不變，然后用3對特異性的引物對所測基因的同一核苷酸序列進行擴增。擴增產物用DNA瓊脂糖凝膠電泳，凝膠掃描觀察分析結果。
實驗材料	DNA
試劑、試劑盒	亞硫酸氫鈉、氫醌、石蠟油、乙醇
儀器、耗材	水浴鍋、PCR儀
實驗步驟	1. 在50 μl 體系中，DNA（2~5 μg）經NaOH（終濃度值0.2 mol/L）在37℃變性10 Min。 2. 對于ng級別的人基因組DNA，在進行修飾前加入2μg蛙魚精DNA為載體。 3. 加入30 μl 剛配制好的10 mmo/L 氫醌與520/1的40.5%亞硫酸氫鈉混勻。 4. 然后用石蠟油隔絕空氣的條件下，避光在50%溫育16 h。 5. 修飾后的DNA過WizerdDNA純化柱，用50/1 L 水洗脫。 6. 室溫下用NaOH（終濃度為0.3 mol/L）修飾5 min，之后用乙醇沉淀。 7. DNA溶于20 μl 水中，立即使用或在-20℃保存。