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質(zhì)譜MRM技術(shù)定量分析與應(yīng)用
  • 發(fā)布日期:2018-06-19      瀏覽次數(shù):3260
    • 質(zhì)譜多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(multiple reaction monitoring, MRM)技術(shù)作為一種質(zhì)譜檢測(cè)的分析方法,具有特異性強(qiáng)、靈敏度高、準(zhǔn)確度高、重現(xiàn)性好、線(xiàn)性動(dòng)態(tài)范圍寬、自動(dòng)化高通量的突出優(yōu)點(diǎn),這些特質(zhì)能夠滿(mǎn)足今天很多研究領(lǐng)域的迫切需要。通過(guò)MRM技術(shù)進(jìn)行實(shí)時(shí)的定量監(jiān)測(cè)可以進(jìn)行藥代動(dòng)力學(xué)研究、臨床診斷、違禁藥物檢查、食品化妝品等工業(yè)質(zhì)量控制、環(huán)境檢測(cè)、農(nóng)業(yè)植物學(xué)研究以及代謝組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)Biomarker的發(fā)現(xiàn)等相關(guān)研究。

      1. 質(zhì)譜MRM技術(shù)的原理

      MRM技術(shù)是一種基于已知或假定的反應(yīng)離子信息,有針對(duì)性地選擇數(shù)據(jù)進(jìn)行質(zhì)譜信號(hào)采集,對(duì)符合規(guī)則的離子進(jìn)行信號(hào)記錄,去除不符合規(guī)則離子信號(hào)的干擾,通過(guò)對(duì)數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)分析從而獲取質(zhì)譜定量信息的質(zhì)譜技術(shù)。MRM技術(shù)是在單反應(yīng)監(jiān)測(cè)(single reaction monitoring, SRM)技術(shù)的基礎(chǔ)上演化而來(lái)的。對(duì)于MRM技術(shù)而言關(guān)鍵在于首先要能夠檢測(cè)到具有特異性的母離子,然后只將選定的特異性母離子進(jìn)行碰撞誘導(dǎo)(collision-induced),后去除其他子離子的干擾,只對(duì)選定的特異子離子進(jìn)行質(zhì)譜信號(hào)的采集。由于三重四級(jí)桿質(zhì)譜(triple quadrupole system, TQS) 是進(jìn)行單一質(zhì)荷比掃描靈敏的質(zhì)譜系統(tǒng),因此是適合MRM分析的質(zhì)譜儀器。

      2. 質(zhì)譜MRM技術(shù)的特點(diǎn)

      MRM技術(shù)的特點(diǎn):①靈敏度高:通過(guò)兩級(jí)離子選擇,排除大量干擾離子,使質(zhì)譜的化學(xué)背景降低,目標(biāo)檢測(cè)物的信噪比顯著提高,從而實(shí)現(xiàn)檢測(cè)的高靈敏度。②重現(xiàn)性好:在MRM 技術(shù)選擇性的質(zhì)譜信號(hào)采集中,避免了待測(cè)分子離子化、質(zhì)譜信號(hào)的抑制及源內(nèi)碰撞碎裂過(guò)程的影響,因此重現(xiàn)性也相應(yīng)提高。③準(zhǔn)確度高:利用MRM技術(shù)的特異性,進(jìn)行連續(xù)增強(qiáng)的離子掃描分析,得到高分辨的串聯(lián)質(zhì)譜(MS/MS)碎片數(shù)據(jù),與全掃描和中性丟失質(zhì)譜掃描模式相比降低了分析過(guò)程中定性結(jié)果的假陽(yáng)性率,保證了分析的準(zhǔn)確度。④通量高:使用目前先進(jìn)的質(zhì)譜系統(tǒng),MRM技術(shù)每個(gè)工作循環(huán)能處理多達(dá)300對(duì)母離子-子離子對(duì),這種特點(diǎn)為研究多種蛋白質(zhì)的多種修飾和豐度變化提供了機(jī)會(huì),更能滿(mǎn)足蛋白質(zhì)組學(xué)的研究需求。
       


       (a) MRM掃描技術(shù)在三重四級(jí)桿質(zhì)譜中的執(zhí)行模式。(b) MRM MS在一次操作中同時(shí)對(duì)14種不同分析物質(zhì)的監(jiān)測(cè)圖

      3. 質(zhì)譜MRM技術(shù)在定量分析中的應(yīng)用

      3.1 MRM技術(shù)在化學(xué)小分子定量分析中的應(yīng)用

      MRM定量分析技術(shù)在化學(xué)小分子分析中已經(jīng)應(yīng)用超過(guò)30年了,報(bào)道出現(xiàn)在1978年用于氯的同位素研究,一年后這種技術(shù)被應(yīng)用于血藥濃度的代謝檢測(cè)中。自三重四級(jí)桿質(zhì)譜問(wèn)世以來(lái),MRM技術(shù)便成為進(jìn)行低分子量化學(xué)物質(zhì)分析的重要方法。特別是在復(fù)雜藥物代謝研究中MRM成為了關(guān)鍵的核心技術(shù),MRM能夠?qū)η八幒推浯x產(chǎn)物進(jìn)行高度和高靈敏度的實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)。此后,在大量具有生物相關(guān)性的小分子化學(xué)物質(zhì)的分析中開(kāi)始應(yīng)用。例如:內(nèi)源物質(zhì)的跟蹤,治療劑及其代謝產(chǎn)物的監(jiān)測(cè),違禁藥物的檢查和環(huán)境毒物的檢測(cè)等等。隨著基因組的破譯,代謝組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)應(yīng)運(yùn)而生,生命科學(xué)的研究領(lǐng)域從此被極大地拓寬了。

      3.2 MRM技術(shù)在代謝組學(xué)定量分析中的應(yīng)用

      代謝組學(xué)是對(duì)生物化學(xué)過(guò)程中的代謝產(chǎn)物進(jìn)行整體而又全面分析的科學(xué)。盡管MRM技術(shù)的應(yīng)用從小分子物質(zhì)延伸到了對(duì)內(nèi)源以及外源代謝產(chǎn)物的分析,但還是受到代謝組學(xué)研究本身的諸多限制。代謝組復(fù)雜而多變,據(jù)估測(cè)人體中大約有7000多種分子,因此代謝組的廣域性已經(jīng)超出了質(zhì)譜檢測(cè)的能力范圍。然而,預(yù)測(cè)代謝和選擇性代謝組的出現(xiàn)將研究者的目光引向了靶向掃描的概念,使可以在MRM模式下應(yīng)用多種選擇離子監(jiān)控技術(shù)對(duì)海量的代謝產(chǎn)物進(jìn)行實(shí)時(shí)的掃描監(jiān)控。雖然MRM技術(shù)不能夠作為代謝組學(xué)主要的掃描手段被應(yīng)用,但是QTRAP質(zhì)譜系統(tǒng)的出現(xiàn)使MRM技術(shù)為靶向蛋白質(zhì)組學(xué)發(fā)現(xiàn)階段的研究提供了更寬的思路。

      3.3 MRM技術(shù)在蛋白質(zhì)組學(xué)定量分析中的應(yīng)用

      蛋白質(zhì)組學(xué)的研究對(duì)象是一個(gè)在時(shí)間和空間上動(dòng)態(tài)變化的整體,具有的復(fù)雜性。隨著蛋自質(zhì)組學(xué)研究的深入和發(fā)展,尤其是差異蛋白質(zhì)組學(xué)研究的進(jìn)展,大量功能蛋白質(zhì)和潛在疾病蛋白質(zhì)標(biāo)志物被發(fā)現(xiàn)并被鑒定,如何進(jìn)一步探測(cè)這些蛋白質(zhì)的表達(dá)豐度,以闡明其功能和在疾病研究中的意義,已變得越來(lái)越重要。僅僅依賴(lài)蛋白質(zhì)大規(guī)模分離、鑒定的技術(shù)路線(xiàn)(雙向凝膠電泳技術(shù)分離蛋白質(zhì),質(zhì)譜技術(shù)鑒定蛋白質(zhì))已經(jīng)不能滿(mǎn)足這些研究的需求,因而迫切需要更高靈敏度和更高選擇性的研究方法。而MRM技術(shù)作為一種高特異性、高靈敏度的質(zhì)譜數(shù)據(jù)獲取方式,在進(jìn)行蛋白質(zhì)組學(xué)更具針對(duì)性的研究中能夠發(fā)揮重要作用,逐步受到更多研究者的關(guān)注。

      復(fù)雜組分共流出物的干擾和寬達(dá)9個(gè)數(shù)量級(jí)以上的動(dòng)態(tài)范圍,一直是影響血清或血漿等生物體液中蛋白質(zhì)、多肽準(zhǔn)確定量的關(guān)鍵因素。盡管研究者們也嘗試采用多種方法,包括盡可能充分的色譜分離,去除高豐度蛋白質(zhì)等,但質(zhì)譜對(duì)低豐度蛋白質(zhì)的檢測(cè)靈敏度和精密度仍不能滿(mǎn)足分析的要求。MRM技術(shù)在定量蛋白質(zhì)組學(xué)應(yīng)用上展現(xiàn)了其方法的優(yōu)點(diǎn)。首先,在一定程度上提高了測(cè)定的動(dòng)態(tài)范圍,其原因一方面是因?yàn)閷?duì)離子的選擇檢出,降低了復(fù)雜組分的背景信號(hào),增強(qiáng)了一些低豐度蛋白質(zhì)的檢測(cè)靈敏度;另一方面通過(guò)對(duì)高豐度、低豐度蛋白質(zhì)MRM離子對(duì)的選擇來(lái)均衡兩者的響應(yīng)信號(hào)差異。例如,對(duì)高豐度蛋白質(zhì),選擇響應(yīng)豐度較低的母離子-子離子對(duì);對(duì)低豐度蛋白質(zhì),選擇響應(yīng)程度較高的母離子-子離子對(duì),從而均衡高、低豐度的信號(hào)差異。其次,減少了復(fù)雜組分共流出物的干擾,增強(qiáng)了檢測(cè)的特異性。此外,MRM技術(shù)高通量的特點(diǎn),也為多種蛋白質(zhì)的同時(shí)定量提供了條件。MRM技術(shù)通過(guò)與同位素稀釋法或mTRAQ技術(shù)結(jié)合,對(duì)已知量加入的內(nèi)標(biāo)肽段和樣本中的真實(shí)肽段分別進(jìn)行標(biāo)記,選擇不同母-子離子對(duì)獲得不同的色譜檢出信號(hào),比較兩者信號(hào),從而產(chǎn)生絕dui定量結(jié)果。

      4. 結(jié)語(yǔ)

      MRM方法具有很好的開(kāi)發(fā)前景,但同時(shí)也面臨巨大的技術(shù)挑戰(zhàn)。從文獻(xiàn)報(bào)道中我們可以看到基于MRM技術(shù)所建立起來(lái)的一系列定量分析方法種類(lèi)較多,可變性強(qiáng),適用范圍廣,可以根據(jù)不同的研究需要選擇不同的樣品前處理實(shí)驗(yàn)方案與之相配合適用,從而發(fā)揮出MRM技術(shù)強(qiáng)大的定量分析潛力。

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